本生快訊——ELISA實驗操作注意事項及常見問題解答

　　一、ELISA操作前準備工作

　　試劑盒的選擇

　　ELISA操作前，應(yīng)做好實驗的設(shè)計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。

　　樣本處理

　　在收集標本前需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集標本，請取材后，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。

　　二、ELISA標準品溶解

　　標準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標尺，因此標準品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節(jié)：凍干標準品溶解按照說明書的要求，準確復(fù)溶。在冰上操作標準品為佳，靜止5-10分鐘，輕輕搖勻后按照一次量分裝，在-20度或-70度保存。標準品嚴禁反復(fù)凍融。標準品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準備，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備;稀釋時，應(yīng)充分混勻;采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實驗孔內(nèi)進行倍比稀釋時，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。

　　三、ELISA操作中的洗滌

　　洗滌是ELISA實驗中是最多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象，實驗重復(fù)效果差的現(xiàn)象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數(shù)。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象，請比照“手工洗板小貼士"操作：

　　a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會增高。

　　b)特別注意：設(shè)計實驗的時候要考慮實驗孔的位置，保證甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開最好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。

　　c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大。

　　d)每次拍板不要重復(fù)在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要扣干凈。

　　e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數(shù)。洗板時間太短，洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。

　　四、ELISA的標準曲線如何擬合?

　　一般情況按照說明書推薦方法擬合標準曲線。標準曲線可以由酶標儀附帶軟件自動生成，也可手動制作。標準曲線呈“S"形曲線，兩端趨于水平，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測范圍。當標準品的量超過與包被抗體結(jié)合的量，此時標準品已飽和，再增加標準品的量，其OD值不再變化，故當標準品達到一定濃度后，曲線就趨于水平。一般廠商給出的濃度范圍落在中間線性范圍，根據(jù)標準曲線，可以測出樣本的濃度。按照科學分析方法，如果存在“奇異點"或者“污點"，直接采用線性分析不是很好，要對擬合標準曲線的幾個點進行取舍，同時也可改用雙對數(shù)直線擬合或者四因素曲線擬合。

　　五、常見問題

　　1、ELISA試驗出現(xiàn)非常弱的結(jié)果，常見有7種原因，其解決方法如下：

　　1)可能原因：溫育的時間或者溫度不夠;

　　解決方法：校正溫育箱溫度。

　　2)可能原因：顯色反應(yīng)時間太短;

　　解決方法：校正定時鐘準確定時。

　　3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題;

　　解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。

　　4)可能原因：加入抗體/酶的稀釋液濃度太低;

　　解決方法：按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。

　　5)可能原因：酶標儀濾光片不正確;

　　解決方法：檢查酶標儀使用的濾光片。

　　6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡;

　　解決方法：試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。

　　7)可能原因：不正確的試劑儲存方式;

　　解決方法：按照說明書要求保存試劑盒。

　　2、試驗的標準曲線和測定的重復(fù)性差，這是什么原因造成的?

　　答：試驗的標準曲線和測定的重復(fù)性差，這是典型的由測定操作引起的問題，常見原因如下：

　　a)可能原因：加樣本及試劑量不準;孔間不一致;

　　解決方法：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。

　　重復(fù)某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近;

　　重復(fù)測定標本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性;

　　樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

　　b)可能原因：加樣過快，孔間發(fā)生污染;

　　解決方法：重復(fù)測定標本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。

　　c)可能原因：加錯樣本;

　　解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯樣本。

　　d)可能原因：加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū);

　　解決方法：加樣槍頭不要貼壁。

　　e)可能原因：不同批號試劑盒中組分混用;

　　解決方法：不同批號試劑盒中組分不可混用。

　　f)可能原因：溫育時間、洗板、顯色時間不一致;

　　解決方法：檢查時間是否一致。

　　g)可能原因：孔內(nèi)污染雜物;

　　解決方法：離心樣品，排除雜物。

　　h)可能原因：試劑/樣品沒有混勻;

　　解決方法：充分混勻樣品和試劑。

　　i)可能原因：血清標本未*凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血

　　細胞，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)等。

　　解決方法：待血清標本*凝固后做試驗。

　　3、 試驗結(jié)果白板，而且陽性對照不顯色，應(yīng)如何分析和查找原因?

　　答：試驗結(jié)果白板，而且陽性對照不顯色，常見原因如下：

　　a)可能原因：漏加或者誤加試劑;

　　解決方法：檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對標簽。

　　b)可能原因：試劑過期;

　　解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品。

　　c)可能原因：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉

　　等);

　　解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。

　　d)可能原因：溫育的時間或溫度不夠;

　　解決方法：校正溫育箱溫度。

　　e)可能原因：標準品失活或者丟失;

　　解決方法：標準品正確保存、溶解和混勻。

　　f)可能原因：抗體失活或者丟失;

　　解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度

　　g)可能原因：酶失活或者丟失

　　檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20-100倍，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達到1.0左右，此為酶的粗略估計。

　　解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。

　　h)可能原因：顯色底物失活

　　檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。

　　解決辦法：更換顯色底物.

　　4. 試驗結(jié)果空白背景高，這是什么原因造成的?

　　答：試驗結(jié)果空白背景高，常見原因如下：

　　a)可能原因：洗板不干凈;

　　解決方法：充分洗滌，*拍干;洗板要防止交叉污染;濃縮洗液準確配制;吸嘴盡可能一次性使用;加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。

　　b)可能原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過期;

　　解決方法：檢查試劑盒有效期。

　　c)可能原因：試劑稀釋有誤，如加酶的濃度過高;

　　解決方法：請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制;

　　d)可能原因：蒸餾水受酶等污染;

　　解決方法：使用新鮮蒸餾水;

　　e)可能原因：試劑混用;

　　解決方法：不同批號試劑勿混用。

　　f)可能原因：培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時間過長。

　　解決方法：顯色反應(yīng)時間適當縮短。

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